說(shuō)到轉(zhuǎn)染法，小伙伴們應(yīng)該比較熟悉脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，那么細(xì)胞轉(zhuǎn)染你了解多少呢？本期AVT小編給大家分享一下這個(gè)方面的一些知識(shí)，感興趣的來(lái)看一下吧！
細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)初接觸細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的科研人員而言，是一道難過(guò)的坎兒，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低的話，你珍貴的細(xì)胞可能就只能扔掉了。
大家都知道，細(xì)胞是由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，這對(duì)大分子物質(zhì)來(lái)說(shuō)是個(gè)不可透過(guò)的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，為了使核酸穿過(guò)細(xì)胞膜，開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)，大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)。
幾種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)染方法：
1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實(shí)驗(yàn)室***的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。
2、磷酸鈣共沉淀法
該方法可重復(fù)性差，而且磷酸鈣溶液對(duì)溫度、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感，對(duì)細(xì)胞尤其是原代細(xì)胞毒性較大，也不能采用RPMI培養(yǎng)基，因?yàn)槠浜懈邼舛鹊牧姿猁}。
3、電穿孔轉(zhuǎn)染法
電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。
當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無(wú)法轉(zhuǎn)入時(shí)可以用電穿孔法轉(zhuǎn)染。
一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70% 的細(xì)胞?，F(xiàn)在針對(duì)細(xì)胞死亡開(kāi)發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，可以大大的降低細(xì)胞的死亡率，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。
4、病毒感染
對(duì)于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無(wú)法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可以采用病毒感染，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率比較高，適用于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
但是插入的片段長(zhǎng)度有一定限制，最重要的是技術(shù)難度比較高，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及，而且某些病毒起效時(shí)間比較慢，跟不上細(xì)胞這種快速繁殖的速度，如果只是做簡(jiǎn)單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染性價(jià)比不高。
沒(méi)有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)，理想的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，如果只是在細(xì)胞水平做，而且用的是簡(jiǎn)單細(xì)胞系，那么脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是綜合比較起來(lái)不錯(cuò)的一個(gè)方法。
所以，我們主要來(lái)探討一下脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)先規(guī)劃好你的實(shí)驗(yàn)，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h，所以要充分了解細(xì)胞生長(zhǎng)速度，計(jì)算所需脂質(zhì)體和DNA的儲(chǔ)備量，并確認(rèn)有足夠的下列材料：Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑，以及DNA，這個(gè)一定要確認(rèn)好，否則生氣都沒(méi)辦法怪別人。
做好以上準(zhǔn)備后，具體的操作步驟如下：
1、細(xì)胞鋪板
(1)一般會(huì)選擇復(fù)蘇細(xì)胞傳代3-4次(匯合率達(dá)到90%之前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，不要長(zhǎng)到100 %)，從解凍過(guò)程中恢復(fù)過(guò)來(lái)可以穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，傳代次數(shù)高(>30-40)時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和形態(tài)會(huì)改變。
(2)如果提總蛋白，一般選擇六孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，因?yàn)檗D(zhuǎn)染的細(xì)胞提取蛋白的總量能達(dá)到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對(duì)比較少。
(3)傳代條件取決于所用的細(xì)胞系。對(duì)于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞，倍增時(shí)間為16小時(shí)(如HEK293)。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，倍增時(shí)間為36小時(shí)(如原代細(xì)胞)。
(4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一 天或更早時(shí)間鋪板，轉(zhuǎn)染效率可能下降，如果是簡(jiǎn)單細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，可以直接在前一 天晚上鋪板，第二天來(lái)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞密度保持在匯合率為70-90%(這個(gè)前提是轉(zhuǎn)染24h，如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%)，細(xì)胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時(shí)進(jìn)行。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無(wú)血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液，用滅菌后的EP管制備。
以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。
加入轉(zhuǎn)染試劑到每個(gè)孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成**培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(shí)(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體**搭配比例不同，轉(zhuǎn)染前，應(yīng)該摸一個(gè)**配比。質(zhì)粒：脂質(zhì)體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來(lái)檢測(cè)**轉(zhuǎn)染比例，一般質(zhì)粒有帶熒光，可以通過(guò)觀察每組熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。
轉(zhuǎn)染時(shí)，應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒：
1、通過(guò)測(cè)量OD 值來(lái)確定DNA純度和濃度，測(cè)得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會(huì)顯zhu影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。
2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞有很大的毒性作用。
轉(zhuǎn)染時(shí)，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體失效。
血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細(xì)胞然后在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡(比如貼壁較差的細(xì)胞，在PBS洗滌時(shí)很容易沖刷細(xì)胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。
不過(guò)轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的當(dāng)下，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō)，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，但是血清的存在會(huì)影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)需用無(wú)血清培養(yǎng)基opti-MEM來(lái)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。
轉(zhuǎn)染后6小時(shí)更換培養(yǎng)基，因?yàn)閘ipo2000具有一定毒性。
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)添加抗生素來(lái)預(yù)防污染，但是抗生素可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來(lái)預(yù)防污染的抗生素，就會(huì)影響轉(zhuǎn)染，雖然這些抗生素一般情況下對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性時(shí)，就會(huì)使抗生素也進(jìn)入細(xì)胞從而間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。
目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來(lái)操作，非常方便，省去了污染等麻煩。
3、觀察轉(zhuǎn)染的效果
在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄熒光蛋白表達(dá)情況，如下圖所示，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來(lái)對(duì)照，可以放在一個(gè)單獨(dú)的孔中，或是與目標(biāo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，同時(shí)用Q-PCR和者WB來(lái)檢測(cè)。
轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可以通過(guò)兩種方法：
1、復(fù)轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染，前提是該細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少。
2、通過(guò)藥篩來(lái)殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
