海藻糖——高效無(wú)毒的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑

包括干細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞**產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細(xì)胞市場(chǎng)包括上中游的干細(xì)胞存儲(chǔ)制備以及下游的臨床應(yīng)用。

為了使細(xì)胞**產(chǎn)品成功應(yīng)用，細(xì)胞的長(zhǎng)期低溫存儲(chǔ)是必須攻克的技術(shù)難點(diǎn)，因?yàn)榈蜏乇４媸情L(zhǎng)期保存細(xì)胞活力和生化功能的**可用方法。為了避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害，一些生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑已經(jīng)上市。*常用的生物制劑凍干保護(hù)劑，冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜(DMSO)與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。

然而，胎牛血清含有異種動(dòng)物源蛋白，可能會(huì)引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細(xì)胞毒性。據(jù)報(bào)道，DMSO對(duì)組織和細(xì)胞的毒性取決于暴露時(shí)間、溫度和濃度。毒性程度因細(xì)胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細(xì)胞的患者中有不良反應(yīng)的報(bào)道。此外，已知DMSO會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來(lái)影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠干細(xì)胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的生物制劑凍干保護(hù)劑，細(xì)胞冷凍保護(hù)劑。

海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在wan全脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細(xì)菌、酵母、緩步動(dòng)物和線蟲。哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實(shí)是一種有效的冷凍保護(hù)劑，可以減少冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。其保護(hù)作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細(xì)胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。

海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑不具有細(xì)胞毒性，已被有效地用于小鼠精細(xì)胞、成人造血干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，脂肪來(lái)源干細(xì)胞，人類胚胎干細(xì)胞(hESCs) 和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs) 等不同細(xì)胞類型的冷凍儲(chǔ)存。此外，海藻糖生物制劑凍干保護(hù)劑還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細(xì)胞和人類胰島的冷凍儲(chǔ)存。

阻止海藻糖在細(xì)胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來(lái)幫助海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費(fèi)力耗時(shí)，且可能導(dǎo)致**的細(xì)胞損傷。

該研究探究了在沒(méi)有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨(dú)或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑，低溫保存3種不同類型的多能干細(xì)胞系并復(fù)蘇，對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了**研究，包括細(xì)胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標(biāo)記物表達(dá)水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護(hù)劑對(duì)多能干細(xì)胞的低溫保護(hù)能力。

1. 不同冷凍保護(hù)劑組成

所有冷凍保護(hù)劑均現(xiàn)用現(xiàn)配，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)胞均使用CS10冷凍保存。CS10是一種無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物源成分，含有10% DMSO，推薦用于人類多能干細(xì)胞(hPSCs)的冷凍保護(hù)劑。

2. 細(xì)胞的冷凍保存及解凍

細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)，用0.5 mM EDTA解離hESCs RC17，用細(xì)胞消化液解離hiPSCs CTR2#6和AF22，并在新鮮制備的冷凍保護(hù)劑(A,B,C和D)中處理。2.0×10^6細(xì)胞在每種冷凍保護(hù)劑1.5 mL中重懸，然后轉(zhuǎn)移到低溫小瓶中。

低溫小瓶使用冷凍容器進(jìn)行冷卻，該容器冷卻速率約為-1°C/min，放置過(guò)夜后，轉(zhuǎn)移到- 80°C冰箱。再24小時(shí)后，將低溫小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中，并在分析前存儲(chǔ)至少一周。

解凍時(shí)，取出低溫小瓶，37°C水浴加熱直至冰團(tuán)消失，細(xì)胞懸液用溫暖的培養(yǎng)基稀釋。以200g離心3分鐘收集細(xì)胞，并以zhi定的接種量將其接種到適合每種細(xì)胞類型的包被培養(yǎng)容器上。

3. 結(jié)果與討論

①細(xì)胞活力

解凍48?h后，用阿拉瑪藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞活力。

首先，為了確定海藻糖、乙二醇、甘油單獨(dú)使用時(shí)的適宜用量。在不同干細(xì)胞系中分別使用不同濃度的單組分溶液，測(cè)試細(xì)胞復(fù)蘇后的活力并與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明0.5M 海藻糖，10%乙二醇和10%甘油是較為適宜的濃度，但在不同的干細(xì)胞類型之間存在很大的差異。

確定初始濃度后，選定4種冷凍保護(hù)劑配方（詳見(jiàn)上文），對(duì)三種干細(xì)胞系(A) hESCs-RC17， (B) hiPSCs-CTR2#6和(C) ltNES-AF22進(jìn)行冷凍保存及復(fù)蘇，進(jìn)行細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后活力檢測(cè)。并將細(xì)胞存活率與在CS10中冷凍保存的相同細(xì)胞在相同條件下進(jìn)行比較。

當(dāng)細(xì)胞*用海藻糖(冷凍保護(hù)劑A組)冷凍保存時(shí)，解凍后的細(xì)胞恢復(fù)率降低，不同干細(xì)胞類型的細(xì)胞恢復(fù)率從20%到60%不等。

在以海藻糖為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加10% 乙二醇或甘油時(shí)(冷凍保護(hù)劑C組、D組)，RC17和AF22細(xì)胞的細(xì)胞存活率都達(dá)到了與DMSO相似的水平，而在CTR2#6中，甘油的細(xì)胞存活率優(yōu)于乙二醇。

此外，對(duì)比*由乙二醇或甘油組成的對(duì)照冷凍溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確認(rèn)細(xì)胞存活率的增加是乙二醇/甘油+海藻糖聯(lián)合作用的結(jié)果。

這些結(jié)果表明，海藻糖可以有效地用于人類多能干細(xì)胞的冷凍保存，有望替代DMSO，添加10% 乙二醇或甘油可**提高海藻糖冷凍保護(hù)劑的存活率。與對(duì)照組CS10相比，細(xì)胞平均存活率增加。乙二醇/甘油+海藻糖組成的冷凍保護(hù)劑不含血清蛋白，避免了先前報(bào)道的刺激多能干細(xì)胞過(guò)早分化的風(fēng)險(xiǎn)。

②細(xì)胞形態(tài)

干細(xì)胞凍存另一個(gè)重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題是染色體和多能性改變。冷凍和解凍過(guò)程可能在細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶和氣泡，破壞紡錘體微管進(jìn)而誘導(dǎo)染色體異常分離，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)特征和形態(tài)變化。因此，可通過(guò)觀察凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)來(lái)較為直觀地評(píng)估干細(xì)胞染色體及多能潛力受到損害的可能性。

上圖顯示了解凍48小時(shí)后RC17、CTR2#6和AF22的細(xì)胞形態(tài)。相位對(duì)比圖像證實(shí)，在所有細(xì)胞系中，海藻糖復(fù)合冷凍保護(hù)劑均未引起明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)與CS10中保存的細(xì)胞相同。

③標(biāo)志物表達(dá)水平

為了確認(rèn)凍存復(fù)蘇后的RC17、hiPSCs CTR2#6和AF22保留了多能干細(xì)胞的關(guān)鍵性質(zhì)和特征，在解凍48 h后通過(guò)定量RT-PCR分析幾個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)水平。

對(duì)RC17和CTR2#6細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記Nanog, Oct4和Sox2。與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)。

對(duì)AF22細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記Nestin和Sox2。與對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示干細(xì)胞分化潛能未受影響。

④染色體穩(wěn)定性

為了評(píng)估海藻糖冷凍保護(hù)劑對(duì)干細(xì)胞染色體穩(wěn)定性的影響，對(duì)所有三種干細(xì)胞系進(jìn)行常規(guī)核型分型和aCGH，下圖為AF22細(xì)胞系儲(chǔ)存前后的結(jié)果。

總體而言核型保持穩(wěn)定，但檢測(cè)到少量CNVs(染色體2、8、19和22)，其中一些可能已經(jīng)存在于原始細(xì)胞群中，另一些可能是在細(xì)胞體外操作過(guò)程中隨機(jī)產(chǎn)生的，而不是冷凍保存導(dǎo)致，因?yàn)樵趦?chǔ)存前(圖C)和儲(chǔ)存后(圖D)均未觀察到克隆非整倍體或結(jié)構(gòu)染色體畸變。

⑤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/未折疊蛋白水平評(píng)估

該研究還關(guān)注了在CS10或海藻糖中低溫保存是否會(huì)對(duì)多能細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和**UPR通路的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。為了在不同的生理或病理狀態(tài)下維持穩(wěn)態(tài)，ER整合了各種分子和細(xì)胞信號(hào)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR都介導(dǎo)影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡的分子和生化機(jī)制。

總體而言，與對(duì)照組CS10相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR反應(yīng)水平適中。**一種更敏感的細(xì)胞系是CTR2#6，在實(shí)驗(yàn)組B和C中顯示出更高水平的BIP和CHOP水平。表明與CS10相比，海藻糖低溫保存不會(huì)明顯改變多能干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）穩(wěn)態(tài)。

海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）

1、產(chǎn)品名：海藻糖（供注射用）（無(wú)菌）

2、中文名稱：D(+)-海藻糖二水合物

3、英文名稱：D(+)-Trehalose dihydrate (for injection)

4、化學(xué)名稱：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物

5、型號(hào)：Hipo-S

6、含量測(cè)定：99.3%

7、CAS號(hào)：6138-23-4

8、EINECS登錄號(hào)：202-739-6

9、備案登記號(hào)：F20190000452

10、DMF號(hào)：034401

11、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：符合各國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)（Chp,USP,JP,EP）

12、分子式：C12H22O11·2H2O

13、分子量：378.33

14、性狀：白色結(jié)晶性粉末

15、比旋度：+198.8°

16、酸度:6.0

17、氯化物:符合規(guī)定

18、硫酸鹽:符合規(guī)定

19、可溶性淀粉:符合規(guī)定

20、熾灼殘?jiān)?0.04%

21、重金屬:符合規(guī)定

22、水分:9.5%

23、有關(guān)物質(zhì):總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出

24、無(wú)菌：符合規(guī)定

25、微生物限度：無(wú)菌

26、細(xì)菌內(nèi)：<0.1IU/g

27、氮：符合規(guī)定

28、含量測(cè)定：99.3%

29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**

30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運(yùn)輸。

31、貨號(hào)：008001

32、結(jié)構(gòu)式：